12 dezembro, 2015

Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Determinar a resistência microbiana é fundamental para o tratamento de infecções. Os métodos existentes e aplicados na rotina laboratorial são disco-difusão (Kirby e Bauer), difusão em gradiente de concentração (tiras ou fitas), diluição e métodos automatizados.


A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a concentração mais baixa do agente antimicrobiano necessária para inibir o crescimento de um micro-organismo. Além de informar o grau de resistência, a CIM pode dar informações importantes sobre a possível presença de genes envolvidos nos mecanismos de resistência.

A determinação da CIM (quantitativo) é considerada o padrão ouro para testes de sensibilidade, porém o teste de disco-difusão (qualitativo) é mais utilizado por ter um custo mais baixo em comparação a outros métodos.

Os valores de inibição e a análise se um micro-organismo possui sensibilidade ou resistência a um agente antimicrobiano é baseada em manuais criados por órgãos reguladores distribuídos pelo mundo, os quais realizaram testes clínicos prévios. A concentração do antimicrobiano utilizado no teste e sua via de administração indicam aos médicos o tratamento mais eficaz para cada infecção.

Vários estudos demonstram que fornecer resultados rápidos de suscetibilidade pode levar a mudanças consideráveis na terapia antimicrobiana, como redução de custos atribuíveis a pedidos de menos testes laboratoriais, menor número de procedimentos invasivos e menos tempo de permanência dos pacientes em unidades de internação.

Entre as primeiras deficiências dos métodos de teste de suscetibilidade, podemos citar a detecção de alguns mecanismos de resistência aos antimicrobianos, incluindo Beta-lactamases e resistência à vancomicina. No entanto, os procedimentos e equipamentos mais novos possuem melhorias significativas em grande parte dos processos para evitarem resultados improváveis.

Disco-difusão (Kirby e Bauer)

No método de disco-difusão, um disco de papel de filtro de 6 mm impregnado com uma concentração conhecida de um composto antimicrobiano é colocado na placa de ágar Mueller-Hinton (MH). O antimicrobiano se difunde no ágar de acordo com as propriedades de difusão, solubilidade e peso molecular do composto. Juntos, esses fatores resultam em valores de inibição únicos, formando halos de suscetibilidade do antimicrobiano.

Disco-difusão (Foto: Wikimedia).

Ao inocular a placa de MH com uma suspensão do agente patogênico, o crescimento do micro-organismo ocorre simultaneamente com a difusão do composto antimicrobiano. É importante salientar que o tamanho da zona de inibição do crescimento pode ser influenciado pela profundidade do ágar, portanto deve haver uma padronização na produção dos meios de cultura.

O momento em que a bactéria atinge o seu crescimento na placa de MH é demonstrado por um halo de inibição definido em torno do disco. A concentração do antimicrobiano ao halo é correspondente à concentração crítica para inibir o micro-organismo.

Difusão em gradiente de concentração (tira ou fita)

O método de difusão em gradiente de concentração cria um gradiente antimicrobiano na placa de ágar para o teste de suscetibilidade. Os antimicrobianos são impregnados em fitas ou tiras finas com um gradiente de concentração e são marcados na superfície superior com uma escala de concentração.

Após a incubação, os testes são lidos visualizando-se as tiras pela parte superior da placa. A CIM é determinada pela intersecção da parte inferior da zona de inibição de crescimento, em forma de elipse com a tira do teste. Como também envolve a difusão do antimicrobiano na placa de MH, é recomendada a padronização da profundidade do ágar durante a produção dos meios de cultura.

Difusão em gradiente de concentração (Foto: Wikimedia).

Esse método possui boa flexibilidade por permitir o teste dos antimicrobianos escolhidos pelo laboratório, porém o custo de cada fita é alto em comparação com outros métodos. Devido a esse fato, é indicado apenas em situações em que seja necessária a CIM para poucos antimicrobianos ou quando o grupo do micro-organismo não possui valores de referência para disco-difusão.

Os resultados da difusão em gradiente têm boa correlação com o valor da CIM obtida pelos métodos de diluição. No entanto, existem alguns desvios sistemáticos quando combinações de agentes antimicrobianos são empregadas a alguns grupos de micro-organismos. Alguns desses valores devem ser corretamente analisados e revisados, pois podem não ser idênticos.

Diluição

Os testes de diluição são realizados em tubos (macrodiluição) ou placas (microdiluição). Este procedimento envolve a preparação de diluições seriadas de antimicrobianos (1, 2, 4, 8, e 16 mg/mL, por exemplo) em um meio líquido de crescimento.

Cada diluição recebe o inóculo com uma suspensão bacteriana padronizada. Após incubação, os tubos ou microplacas são analisadas quanto ao crescimento do micro-organismo, visualizado pela turvação do meio. A concentração mais baixa de antimicrobiano que impede o crescimento representa a CIM.

Microdiluição (Foto:Wikimedia).

Apesar da precisão por gerar um resultado quantitativo, preparar manualmente as diluições em série dos antimicrobianos no método de macrodiluição é uma tarefa tediosa, com a possibilidade de erros e quantidade relativamente alta de reagentes e espaço necessário para cada teste.

Em contrapartida, a microdiluição possibilita a reprodutibilidade e a conveniência de ter painéis prontos, somando-se à economia de espaço e reagentes que ocorre devido à miniaturização do teste. Os resultados também podem ser informatizados se houver um leitor automatizado do painel. A principal desvantagem do método é a flexibilidade de seleção de drogas disponíveis, pois os painéis comerciais são pré-definidos.

Métodos automatizados

A automação dos testes de sensibilidade padroniza a leitura e muitas vezes produz resultados em um período mais curto do que as leituras manuais. Os sistemas sensíveis de detecção óptica permitem a detecção de mudanças sutis no crescimento do micro-organismos.

Os quatro principais equipamentos de automação utilizados atualmente nos laboratórios de microbiologia são o MicroScan Walk-Away (Siemens Healthcare Diagnostics), o BD Phoenix (BD Diagnostics), o Vitek 2 (bioMérieux) e o Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems). Os três primeiros pode gerar resultados rápidos (3,5-16 h), enquanto o quarto sistema leva mais tempo, processando os resutados após 18-24 h.

O MicroScan WalkAway (Siemens Healthcare Diagnostics) é uma incubadora e leitor auto-suficiente que analisa 40-96 placas de microdiluição. Utiliza placas de microdiluição com tamanho padrão que são hidratados e, em seguida, inoculados manualmente e colocados em um dos locais disponíveis no instrumento. O equipamento incuba as placas e examina-as periodicamente com os fotômetros para determinar se houve crescimento. Em geral, painéis de suscetibilidade de Gram-negativos contendo substratos fluorogênicos são lidos em 3,5-7 h. Painéis separados de Gram-positivos e Gram-negativos ficam prontos em 4,5-18 h, aproximadamente.

MicroScan Walkaway (Siemens Healthcare Diagnostics)

O sistema automatizado de microbiologia BD Phoenix (BD Diagnostics) tem uma grande leitora e incubadora com capacidade para processar 99 painéis de teste que contêm 84 poços dedicados às diluições dos antimicrobianos, inoculadas manualmente. O BD Phoenix monitora os painéis a cada 20 minutos, usando o indicador de turbidez e colorimétrico (indicador de oxidação-redução). Há opções de painéis para quase todos os grupos de bactérias e os resultados de CIM são gerados em 6-16 h.

BD Phoenix (BD Diagnostics)


O sistema Vitek 2 (bioMérieux) é altamente automatizado e utiliza cartões compactos de plástico com reagentes que contêm antimicrobianos e meios de teste em um formato de 64 poços. O Vitek 2 emprega monitorização turbidimétrica do crescimento microbiano durante o período de incubação. O instrumento pode ser configurado para analisar 30-240 testes simultâneos. Os cartões permitem o teste de suscetibilidade para Gram-positivos, Gram-negativos e leveduras. A média de tempo para a obtenção dos resultados é de 4-10 h para bactérias e um pouco superior para o grupo de leveduras.


Vitek 2 (bioMérieux).

O Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems) é um sistema automatizado com capacidade para 64 painéis que utiliza a medição da fluorescência após 18-24 horas de incubação. Os painéis são padronizados com 96 cavidades de microdiluição e são incubados no equipamento. Os testes estão disponíveis para grande parte dos Gram-positivos e Gram-negativos.
Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems).

Embora variem nos métodos e tempo de detecção, todos os equipamentos têm melhorado seus softwares para interpretar os resultados de suscetibilidade, incluindo sistemas que analisam padrões atípicos e fenótipos de resistência incomuns.

Fonte: JORGENSEN, J.H; FERRARO, M.J: Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices, 2009.

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