Metodologia

Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Determinar a resistência microbiana é fundamental para o tratamento de infecções. Os métodos existentes e aplicados na rotina laboratorial são disco-difusão (Kirby e Bauer), difusão em gradiente de concentração (tiras ou fitas), diluição e métodos automatizados.


A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a concentração mais baixa do agente antimicrobiano necessária para inibir o crescimento de um micro-organismo. Além de informar o grau de resistência, a CIM pode dar informações importantes sobre a possível presença de genes envolvidos nos mecanismos de resistência.

A determinação da CIM (quantitativo) é considerada o padrão ouro para testes de sensibilidade, porém o teste de disco-difusão (qualitativo) é mais utilizado por ter um custo mais baixo em comparação a outros métodos.

Os valores de inibição e a análise se um micro-organismo possui sensibilidade ou resistência a um agente antimicrobiano é baseada em manuais criados por órgãos reguladores distribuídos pelo mundo, os quais realizaram testes clínicos prévios. A concentração do antimicrobiano utilizado no teste e sua via de administração indicam aos médicos o tratamento mais eficaz para cada infecção.

Vários estudos demonstram que fornecer resultados rápidos de suscetibilidade pode levar a mudanças consideráveis na terapia antimicrobiana, como redução de custos atribuíveis a pedidos de menos testes laboratoriais, menor número de procedimentos invasivos e menos tempo de permanência dos pacientes em unidades de internação.

Entre as primeiras deficiências dos métodos de teste de suscetibilidade, podemos citar a detecção de alguns mecanismos de resistência aos antimicrobianos, incluindo Beta-lactamases e resistência à vancomicina. No entanto, os procedimentos e equipamentos mais novos possuem melhorias significativas em grande parte dos processos para evitarem resultados improváveis.

Disco-difusão (Kirby e Bauer)

No método de disco-difusão, um disco de papel de filtro de 6 mm impregnado com uma concentração conhecida de um composto antimicrobiano é colocado na placa de ágar Mueller-Hinton (MH). O antimicrobiano se difunde no ágar de acordo com as propriedades de difusão, solubilidade e peso molecular do composto. Juntos, esses fatores resultam em valores de inibição únicos, formando halos de suscetibilidade do antimicrobiano.

Disco-difusão (Foto: Wikimedia).

Ao inocular a placa de MH com uma suspensão do agente patogênico, o crescimento do micro-organismo ocorre simultaneamente com a difusão do composto antimicrobiano. É importante salientar que o tamanho da zona de inibição do crescimento pode ser influenciado pela profundidade do ágar, portanto deve haver uma padronização na produção dos meios de cultura.

O momento em que a bactéria atinge o seu crescimento na placa de MH é demonstrado por um halo de inibição definido em torno do disco. A concentração do antimicrobiano ao halo é correspondente à concentração crítica para inibir o micro-organismo.

Difusão em gradiente de concentração (tira ou fita)

O método de difusão em gradiente de concentração cria um gradiente antimicrobiano na placa de ágar para o teste de suscetibilidade. Os antimicrobianos são impregnados em fitas ou tiras finas com um gradiente de concentração e são marcados na superfície superior com uma escala de concentração.

Após a incubação, os testes são lidos visualizando-se as tiras pela parte superior da placa. A CIM é determinada pela intersecção da parte inferior da zona de inibição de crescimento, em forma de elipse com a tira do teste. Como também envolve a difusão do antimicrobiano na placa de MH, é recomendada a padronização da profundidade do ágar durante a produção dos meios de cultura.

Difusão em gradiente de concentração (Foto: Wikimedia).

Esse método possui boa flexibilidade por permitir o teste dos antimicrobianos escolhidos pelo laboratório, porém o custo de cada fita é alto em comparação com outros métodos. Devido a esse fato, é indicado apenas em situações em que seja necessária a CIM para poucos antimicrobianos ou quando o grupo do micro-organismo não possui valores de referência para disco-difusão.

Os resultados da difusão em gradiente têm boa correlação com o valor da CIM obtida pelos métodos de diluição. No entanto, existem alguns desvios sistemáticos quando combinações de agentes antimicrobianos são empregadas a alguns grupos de micro-organismos. Alguns desses valores devem ser corretamente analisados e revisados, pois podem não ser idênticos.

Diluição

Os testes de diluição são realizados em tubos (macrodiluição) ou placas (microdiluição). Este procedimento envolve a preparação de diluições seriadas de antimicrobianos (1, 2, 4, 8, e 16 mg/mL, por exemplo) em um meio líquido de crescimento.

Cada diluição recebe o inóculo com uma suspensão bacteriana padronizada. Após incubação, os tubos ou microplacas são analisadas quanto ao crescimento do micro-organismo, visualizado pela turvação do meio. A concentração mais baixa de antimicrobiano que impede o crescimento representa a CIM.

Microdiluição (Foto:Wikimedia).

Apesar da precisão por gerar um resultado quantitativo, preparar manualmente as diluições em série dos antimicrobianos no método de macrodiluição é uma tarefa tediosa, com a possibilidade de erros e quantidade relativamente alta de reagentes e espaço necessário para cada teste.

Em contrapartida, a microdiluição possibilita a reprodutibilidade e a conveniência de ter painéis prontos, somando-se à economia de espaço e reagentes que ocorre devido à miniaturização do teste. Os resultados também podem ser informatizados se houver um leitor automatizado do painel. A principal desvantagem do método é a flexibilidade de seleção de drogas disponíveis, pois os painéis comerciais são pré-definidos.

Métodos automatizados

A automação dos testes de sensibilidade padroniza a leitura e muitas vezes produz resultados em um período mais curto do que as leituras manuais. Os sistemas sensíveis de detecção óptica permitem a detecção de mudanças sutis no crescimento do micro-organismos.

Os quatro principais equipamentos de automação utilizados atualmente nos laboratórios de microbiologia são o MicroScan Walk-Away (Siemens Healthcare Diagnostics), o BD Phoenix (BD Diagnostics), o Vitek 2 (bioMérieux) e o Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems). Os três primeiros pode gerar resultados rápidos (3,5-16 h), enquanto o quarto sistema leva mais tempo, processando os resutados após 18-24 h.

O MicroScan WalkAway (Siemens Healthcare Diagnostics) é uma incubadora e leitor auto-suficiente que analisa 40-96 placas de microdiluição. Utiliza placas de microdiluição com tamanho padrão que são hidratados e, em seguida, inoculados manualmente e colocados em um dos locais disponíveis no instrumento. O equipamento incuba as placas e examina-as periodicamente com os fotômetros para determinar se houve crescimento. Em geral, painéis de suscetibilidade de Gram-negativos contendo substratos fluorogênicos são lidos em 3,5-7 h. Painéis separados de Gram-positivos e Gram-negativos ficam prontos em 4,5-18 h, aproximadamente.

MicroScan Walkaway (Siemens Healthcare Diagnostics)

O sistema automatizado de microbiologia BD Phoenix (BD Diagnostics) tem uma grande leitora e incubadora com capacidade para processar 99 painéis de teste que contêm 84 poços dedicados às diluições dos antimicrobianos, inoculadas manualmente. O BD Phoenix monitora os painéis a cada 20 minutos, usando o indicador de turbidez e colorimétrico (indicador de oxidação-redução). Há opções de painéis para quase todos os grupos de bactérias e os resultados de CIM são gerados em 6-16 h.

BD Phoenix (BD Diagnostics)


O sistema Vitek 2 (bioMérieux) é altamente automatizado e utiliza cartões compactos de plástico com reagentes que contêm antimicrobianos e meios de teste em um formato de 64 poços. O Vitek 2 emprega monitorização turbidimétrica do crescimento microbiano durante o período de incubação. O instrumento pode ser configurado para analisar 30-240 testes simultâneos. Os cartões permitem o teste de suscetibilidade para Gram-positivos, Gram-negativos e leveduras. A média de tempo para a obtenção dos resultados é de 4-10 h para bactérias e um pouco superior para o grupo de leveduras.


Vitek 2 (bioMérieux).

O Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems) é um sistema automatizado com capacidade para 64 painéis que utiliza a medição da fluorescência após 18-24 horas de incubação. Os painéis são padronizados com 96 cavidades de microdiluição e são incubados no equipamento. Os testes estão disponíveis para grande parte dos Gram-positivos e Gram-negativos.
Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems).

Embora variem nos métodos e tempo de detecção, todos os equipamentos têm melhorado seus softwares para interpretar os resultados de suscetibilidade, incluindo sistemas que analisam padrões atípicos e fenótipos de resistência incomuns.

Fonte: JORGENSEN, J.H; FERRARO, M.J: Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices, 2009.

Artigo por: Raphael Gonçalves Nicésio

Os artigos do blog são destinados a estudantes, profissionais e pessoas que se interessam pela biomedicina e demais áreas da saúde. O conteúdo não visa substituir as orientações de um médico, portanto não deve ser utilizado para autodiagnóstico ou automedicação.

Licença Creative Commons
Esta publicação está licenciada com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional. Não é permitido duplicar, copiar ou reproduzir qualquer parte sem autorização prévia.

0 comentários:

Postar um comentário

2007-2016. Biomedicina Brasil. Tecnologia do Blogger.