Metodologia

Coloração de Gram

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas.

O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constituindo-se uma peça importante e fundamental. Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local.

Os custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um balcão com pia e um bico de Bunsen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio com objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratório treinados, responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho.

Princípio

Nas bactérias Gram-positivas a parede celular é formada principalmente por ácidos teicóicos e nas bactérias Gram-negativas, é formada principalmente por lipídeos. Por possuírem grande quantidade de ácidos teicóicos, após a coloração, as Gram-positivas formam um complexo corado azul intenso, que não é removido facilmente com álcool-acetona. As Gram-negativas não retêm a coloração após o tratamento com álcool-acetona e são reveladas posteriormente com solução de fucsina ou safranina, apresentando-se na coloração avermelhada.



Variações

A técnica de coloração de Gram geralmente respeita um protocolo de ações que a padroniza. Contudo, há variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execução da coloração e à utilização de lavagem com água em dadas etapas que podem ou não interferir na visualização das estruturas coradas.

Como exemplo, o método original utiliza violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina baseado no espectro de cores, já que esta última mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciando com maior nitidez as bactérias Gram-negativas.

Procedimento

1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe por aproximadamente 1 minuto;
2. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente;
3. Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
5. Adicione álcool-acetona sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave em um filete de água corrente;
9. Deixe secar ao ar livre;
10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
11. Leia em objetiva de imersão (100x).



Referências: Newslab / Ministério da Saúde

Artigo por: Raphael Gonçalves Nicésio

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41 comentários:

  1. Qual o tipo de bactéria é mais patogênica?

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    1. Camilla, a patogenicidade da bactéria não está relacionada com a coloração, mas sim com a espécie envolvida, seus mecanismos de resistência e sítio anatômico do organismo no qual ela se encontra.

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    2. A bactéria do tipo GRAM - é a mais patogênica, pois quando morrem liberam o LPS, que é o responsável pelos sintomas como febre, dilatação de vasos venosos, choque.

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    3. Não existe bactéria do tipo GRAM. Gram é o nome do médico e, consequentemente, da coloração utilizada na bacteriologia.

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    4. A pessoa de cima colocou (GRAM - ) gram negativa, e sim, ela é mais patogenica

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  2. obrigado pelo blog esta sendo de fonte rica.....

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  3. Qual a importância da coloração de Gram para diagnosticar doenças e tratá-las?

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    1. A coloração de Gram é utilizada para triagem e/ou diagnóstico presuntivo de infecções, pois antecipa ao médico a possível causa da infecção por bactérias patogênicas, enquanto o resultado da cultura não está liberado.

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  4. Porque é necessário a coloração com dois corantes?

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    1. Resumidamente: porque há bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e dependendo do corante retido (cristal violeta ou fucsina), a bactéria apresentará coloração roxa ou vermelha, respectivamente.

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  5. luciana 02 de dezembro de 2015 15:08 poderia passar os procedimentos mais pratico de analises de àgua,coloraçao de grans positivas e negativas,antibiograma?

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    1. Luciana, o procedimento de coloração de Gram já está no artigo. Quanto às análises de água e ao antibiograma, anotarei suas sugestões para futuros artigos no blog.

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  6. Qual a função dos corantes na coloração de Gram?

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    1. Na técnica de Gram, o Cristal Violeta e Fucsina/Safranina coram as bactérias em Gram-positivas (roxas) ou Gram-negativas (vermelhas), permitindo o diagnóstico presuntivo de infecções pela microscopia.

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  7. Porque algumas bactérias não podem ser coradas pela coloração de Gram?

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    1. Algumas bactérias possuem paredes muito espessas, e, portanto, são impermeáveis aos corantes utilizados na coloração de Gram. As micobactérias, chamadas de bacilos álcool-ácido resistentes, são um exemplo desse grupo.

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  8. quem foi a pessoa especifica que deu esse nome a essa tecnica ?

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  9. Tempo de cada soluçao utilizada na tecnica de gram.?

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    1. Há algumas variantes na técnica, relacionadas aos tempos de execução da coloração. O indicado é testar cada uma para definir qual se adapta melhor ao seu laboratório.

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  10. O que acontece se for usado a safranina(fucsina) antes do cristal de violeta ? A coloração dá certo ?

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    1. Provavelmente não, porque a ordem dos reagentes é importante. No caso, o álcool-acetona é utilizado para remover o cristal violeta das bactérias Gram-negativas, antes de serem coradas pela fucsina/safranina.

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  11. Em aula prática, um aluno esqueceu de finalizar a coloração de Gram, deixando de adicionar o último corante. Qual tipo de
    bactéria não será possível ele visualizar, com certeza? Justifique sua resposta.

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  12. Qual é a parte mais importante da técnica de Gram?

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    1. Todas as partes são importantes. Qualquer etapa não realizada ou modificada na técnica altera o resultado da coloração.

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  13. Quais são os corantes e os reagentes? Qual a diferença deles?

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    1. Laura, os corantes são o cristal violeta e a fucsina/safranina. Os reagentes são o lugol (utilizado para reter o cristal violeta) e o descorante álcool-acetona.

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  14. como posso colocar tal material como referencia em um trabalho?
    quem publicou? qual o ano ?

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    1. Você pode utilizar o Biomedicina Brasil como fonte, ou a referência do projeto Telelab, publicado em 1997 (Ministério da Saúde).

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  15. Boa Tarde. Eu queria saber, Por que é realizada a coloração de Gram na rotina médica?

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    1. A coloração de Gram é realizada para diferenciar as bactérias Gram-positivas das Gram-negativas, pois alguns antibióticos só são eficazes para certos grupos bacterianos e esse fato antecipa a escolha do antimicrobiano mais adequado pelo médico.

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  16. Bom dia, gostaria de saber qual a importância da coloração de Gram para indústrias de alimentos

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    1. A coloração de Gram é importante pois permite diferenciarmos as bactérias Gram-negativas das Gram-positivas, permitindo uma conduta adequada na área clínica ou na área de alimentos.

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  17. Oi. Eu gostaria de saber quais os possíveis resultados do método de coloração de Gram e o que eles indicam. Preciso das respostas urgente, por favor. Desde já, agradeço.

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    1. A coloração de Gram pode exibir dois resultados: Gram-positivo ou Gram-negativo. No entanto, algumas bactérias podem ser Gram-variáveis.

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  18. por que os reagentes devem ser aplicados na ordem especifica?????

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    1. Porque cada reagente tem uma função dentro do protocolo.

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  19. boa tarde, gostaria de saber qual é a principal estrutura bacteriana envolvida na coloração de Gram.

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    1. A coloração de Gram tem relação com as estruturas da membrana bacteriana, que retêm ou não o corante.

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