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O que são plasmídeos?

Plasmídeos são pequenos pedaços circulares de DNA que se replicam independentemente do cromossomo da célula hospedeira, têm importante papel como vetores de clonagem e são amplamente utilizados na biologia molecular. Nos micro-organismos, os plasmídeos têm funções adaptativas, já que podem garantir a sobrevivência de bactérias pela presença de genes de resistência a antibióticos, por exemplo.

Os primeiros plasmídeos utilizados em laboratório foram derivados de plasmídeos naturais encontrados em bactérias. Desde a sua descoberta, pesquisadores adicionaram muitas características aos plasmídeos para adequação a uma variedade de aplicações. Foram projetados para transportar até 10 quilobases de DNA e são facilmente isolados de micro-organismos por métodos laboratoriais.


Embora os plasmídeos se repliquem independentemente do DNA cromossômico, eles dependem de enzimas hospedeiras para catalisar a sua replicação. As DNA polimerases do hospedeiro ligam-se a uma sequência de origem de replicação (ori) no plasmídeo.

Naturalmente encontrados em micro-organismos, os plasmídeos podem ser transferidos entre espécies por transformação ou conjugação, mas geralmente têm uma gama restrita de hospedeiros. A grande maioria pertence às bactérias, mas os plasmídeos também podem ser encontrados em cepas de Saccharomyces cerevisiae, que carregam um grande plasmídeo conhecido como plasmídeo de 2 μm.

Os plasmídeos que se replicam em bactérias têm sequências que se ligam à DNA polimerase bacteriana, enquanto que os plasmídeos que se replicam em leveduras têm sequências distintas que se ligam à DNA polimerase de levedura.

Atuando em alguma parte do metabolismo da célula hospedeira, os plasmídeos normalmente seriam perdidos se não conferissem alguma vantagem seletiva ao hospedeiro. Carregam, portanto, genes para marcadores selecionáveis, que permitem que células transformadas cresçam nas condições em que células não transformadas são incapazes de crescer.

Um exemplo clássico é a presença do gene de 𝛽-lactamase (ampᣴ) no DNA recombinante, que permite o crescimento da bactéria Escherichia coli na presença de ampicilina, um antibiótico que interfere na síntese da parede celular bacteriana. Além disso, o gene de levedura URA-3 pode estar presente, permitindo o crescimento das células portadoras do plasmídeo nos meios pobres em uracila.

O DNA recombinante também pode ser introduzido em células eucarióticas de mamíferos. Com a utilização de vírus previamente tratados como vetores, o DNA é incorporado à célula hospedeira sem causar danos.

Nomenclatura dos plasmídeos

A nomenclatura adequada é importante para distinguir plasmídeos. O "p" denota que é um plasmídeo, enquanto o restante do nome é um código usado pelos pesquisadores que o criaram. Muitas vezes, as letras no nome de um plasmídeo contêm as iniciais do pesquisador que realizou a sua construção ou as iniciais do marcador de resistência. Em seguida alguns possuem um número da versão e, separado por hífen, podem conter o nome do ORF (open reading frame) clonado em itálico.

O pBR322 foi um dos primeiros plasmídeos amplamente utilizados como vetor de clonagem. Com 4.361 pares de bases e dois genes de resistência (ampicilina e tetraciclina), o vetor foi nomeado pelos pesquisadores que o criaram, Bolivar e Rodriguez (BR), e ainda possui regiões para mais de quarenta enzimas de restrição.


Isolamento de plasmídeos

O isolamento de plasmídeos é realizado atualmente por kits comerciais, que suprem as necessidades do procedimento e são relativamente baratos. Os kits rendem DNA de alta qualidade, evitando a necessidade de desnaturantes orgânicos. Porém há uma grande variedade de procedimentos menos dispendiosos, mas um pouco mais demorados. Nos protocolos não comerciais, o DNA pode ter menos pureza do que o purificado com kits.

Ao contrário do cromossomo bacteriano, também circular mas muito maior, os plasmídeos são muito resistentes à desnaturação. Qualquer que seja o procedimento, os princípios básicos de isolamento do plasmídeo são os mesmos.

Lise e desnaturação ⇾ os procedimentos mais comuns usam uma combinação de base forte e um detergente para enfraquecer a parede celular bacteriana resistente. Os detergentes ajudam a solubilizar os lipídios na parede celular, permitindo que os desnaturantes entrem na célula. As proteínas, por causa de suas estruturas frágeis, são irreversivelmente desnaturadas. O tratamento também rompe as ligações de hidrogênio que mantêm o DNA cromossômico e plasmidial juntos.

Neutralização ⇾ permite que as cadeias complementares de DNA se reanelem e provoquem a precipitação de proteínas. Os plasmídeos renaturam porque têm estruturas superenroladas que mantêm as duas cadeias da hélice juntas durante a desnaturação. O DNA cromossômico não é capaz de renaturar porque as suas cadeias mais longas se misturam com proteínas desnaturadas.

Centrifugação ⇾ o DNA plasmidial é separado de grandes agregados de proteínas precipitadas e DNA cromossômico, por centrifugação.

Purificação ⇾ os plasmídeos são finalmente purificados por extração orgânica ou adsorção a uma resina.

2 comentários:

  1. Muito bom! Entrei no mestrado e agora esses danados estão quebrando minha cabeça hehehe

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    1. Também passei por isso Brunno, dá muito trabalho mesmo!

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