10.4.17

Enzimas de Restrição

A construção de moléculas de DNA recombinante, ou seja, a ligação de segmentos específicos de moléculas de DNA de origens diferentes, é uma técnica que pode ser desenvolvida graças à descoberta das enzimas de restrição ou endonucleases.


O que são essas enzimas? 

As enzimas de restrição foram descobertas e isoladas de inúmeras espécies de bactérias as quais têm a função de protegê-las de infecções virais. Os vírus bacterianos, ou fagos, ao invadirem o interior da bactéria, têm seu DNA cortado em sítios específicos, causando assim a restrição de seu ciclo de replicação que levaria à lise ou destruição da bactéria.

Como funcionam as enzimas de restrição?

As enzimas de restrição são proteínas que têm a capacidade de reconhecer, na dupla hélice do DNA, sítios de clivagem, ou seja, sequências específicas de 4 ou 6 bases. Uma vez reconhecido, é realizado um corte específico em cada ponto ou sítio em que as moléculas da enzima se ligam.

Esses sítios, além de estarem presentes no vírus, também existem no DNA de todos os outros organismos, inclusive na própria bactéria que produz a enzima. Para evitar que seu próprio DNA seja cortado e, portanto, tornado inativo na bactéria, esses sítios de restrição aparecem ligados a uma molécula do grupo metil (CH₃) que impede a ação da enzima.

Uma das características mais importantes das enzimas de restrição é a especificidade, ou seja, uma mesma molécula de DNA submetida à ação de uma enzima é sempre cortada nos mesmos pontos e gera um conjunto de fragmentos de mesmo tamanho. Portanto, quaisquer duas moléculas de DNA de mesmo tamanho, contendo os mesmos sítios de restrição nas mesmas posições, resultam em conjuntos de fragmentos de tamanho idêntico.

Da mesma forma, porém, quaisquer alterações no DNA fora dos sítios digeridos pela enzima não são detectadas por esse método. Como esses sítios são relativamente raros (em geral bem menos de 1 por 1000 pares de bases - pb), moléculas diferentes podem apresentar o mesmo padrão de fragmentos ao serem cortadas com enzimas.


Como identificar os fragmentos cortados?

A separação de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos pode ser feita através de um processo relativamente simples e rápido, a eletroforese em gel de agarose. O gel representa, na verdade, uma “peneira” ou matriz capaz de retardar diferencialmente o movimento de moléculas de tamanhos variados. A molécula de DNA, devido à presença do ácido fosfórico, apresenta carga negativa, de modo que, quando submetida a um campo elétrico, em pH neutro, é atraída para o pólo positivo.

A primeira etapa do processo da eletroforese consiste em colocar a amostra de DNA em uma cavidade ou poço, na extremidade do gel. Em seguida, deve-se fazer uma corrente elétrica passar pelo gel colocando o pólo positivo (ânodo) na extremidade oposta. Desta forma, após algum tempo, encontram-se, a partir do ponto de aplicação, as moléculas distribuídas em ordem decrescente de tamanho.

Para a visualização, o DNA é corado com um reagente fluorescente que se intercala na molécula, o brometo de etídio (EtBr). Os fragmentos podem ser, então, observados sob luz ultravioleta (UV).

Fonte: Sociedade Brasileira de Genética.

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