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Cepas de referência

As cepas de referência destinam-se à verificação dos resultados obtidos, pois suas características fenotípicas já são conhecidas, ou seja, sua identificação e seu perfil de sensibilidade já foram determinados. Devem possuir uma origem confiável, vindo de um laboratório de referência que realiza testes fenotípicos e moleculares para confirmar sua identificação e perfil de sensibilidade.
Define-se como cultura de estoque o subcultivo das cepas de referência. Essa cultura é armazenada no laboratório de microbiologia (a -20°C ou menos) e é descongelada anualmente.
A cultura de trabalho é o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque e mantida no laboratório (4°C a 8°C) para realização dos testes diários ou semanais do Controle Interno de Qualidade.
Uma passagem é a transferência do organismo de uma cultura viável para um novo meio de cultura com crescimento de microrganismos. A hidratação (ou decongelamento) de uma cepa de referência não é considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem será o subcultivo da cepa de referência para a cultura de estoque. A transferência do microrganismo da cultura de estoque para a cultura de trabalho será a segunda passagem.
As cepas de referência têm um número máximo de gerações a qual podem ser submetidas, são cinco passagens a partir da cepa de referência original. O número indefinido de passagens pode comprometer principalmente a pureza da cultura e as características fenotípicas de algumas bactérias.

Propagação da cultura de bactérias.
Seguindo os procedimentos padronizados e em condições ideais de armazenagem, a passagem para a produção das culturas de estoque pode ser anual e a passagem das culturas de trabalho pode ser realizada a cada três semanas. Algumas cepas devem ser mantidas em condições especiais devido a suas características intrínsecas (ex. cepas exigentes).
• As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e métodos empregados para testes de isolados clínicos.
• No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referência devem ser mantidas a temperatura de -20°C, ou menos, (de preferência a -60°C ou menos, ou em nitrogênio líquido) em meio estabilizador recomendado.
Em geral, as bactérias podem ser estocadas a -20°C por 1–3 anos, a -70°C por 1–10 anos e em nitrogênio líquido a -196°C por mais de 30 anos.
Meios utilizados para a manutenção das cepas de referência:
- Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em pó dissolvido em água destilada, autoclavar a 121°C por 20 minutos.
- Caldo de soja tríptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121°C por 20 minutos.
- Sangue de coelho desfibrinado.
• OBS: Os criotubos com selo de proteção interna são os mais utilizados para o processo de armazenamento dessas amostras. Os criotubos são preparados com antecedência, em volumes que, em geral estão em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto à esterilidade.

Armazenamento de cepas fúngicas

• Para o armazenamento prolongado das cepas de referência, as leveduras devem ser cultivadas em ágar batata-dextrose e depois congeladas a -70°C. Alternativamente, as cepas de referência (não Cryptococcus) podem ser cultivadas suspendendo as células fúngicas em solução de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenados a -70°C.
• Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padrão de trabalho, ou seja, de uso rotineiro nos testes, devem ser cultivadas a 35°C (+ 2°C) em tubos de ágar-Sabouraud ou ágar sangue, em tubos inclinados, até se observar crescimento suficiente, sendo depois armazenadas à temperatura de 2 a 8°C, enquanto não são utilizadas nos testes.



Referência:
OPAS, ANVISA, SVS. Controle Interno da Qualidade para Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos.

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