Biologia Molecular

Enzimas de restrição

A construção de moléculas de DNA recombinante, ou seja, a ligação de segmentos específicos de moléculas de DNA de origens diferentes, é uma técnica que pode ser desenvolvida graças à descoberta das enzimas de restrição ou endonucleases.

O que são essas enzimas?

As enzimas de restrição foram descobertas e isoladas de inúmeras espécies de bactérias as quais têm a função de protegê-las de infecções virais. Os vírus bacterianos, ou fagos, ao invadirem o interior da bactéria, têm seu DNA cortado em sítios específicos, causando assim a restrição de seu ciclo de replicação que levaria à lise ou destruição da bactéria.

Como funcionam as enzimas de restrição?

As enzimas de restrição são proteínas que têm a capacidade de reconhecer, na dupla hélice do DNA, sítios de clivagem, ou seja, sequências específicas de 4 ou 6 bases. Uma vez reconhecido, é realizado um corte específico em cada ponto ou sítio em que as moléculas da enzima se ligam.

Esses sítios, além de estarem presentes no vírus, também existem no DNA de todos os outros organismos, inclusive na própria bactéria que produz a enzima.

Para evitar que seu próprio DNA seja cortado e, portanto, tornado inativo na bactéria, esses sítios de restrição aparecem ligados a uma molécula do grupo metil (CH3) o que impede a ação da enzima.
Uma das características mais importantes dessas enzimas é a sua especificidade, ou seja, uma mesma molécula de DNA submetida à ação de uma enzima é sempre cortada nos mesmos pontos e gera um conjunto de fragmentos de mesmo tamanho. Essa característica permite uma análise relativamente grosseira, porém bastante efetiva do ponto de vista prático na identificação de diferentes moléculas de DNA, permitindo o diagnóstico de organismos contendo pequenas alterações nas bases do material genético. É óbvio que, quaisquer duas moléculas de DNA de mesmo tamanho, contendo os mesmos sítios de restrição nas mesmas posições, resultam em conjuntos de fragmentos de tamanho idêntico.

Da mesma forma, porém, quaisquer alterações no DNA fora dos sítios digeridos pela enzima não são detectadas por esse método. Como esses sítios são relativamente raros (em geral bem menos de 1 por 1000 pares de bases - pb), moléculas diferentes podem apresentar o mesmo padrão de fragmentos ao serem cortadas com enzimas.

Enzimas de restrição
Origem 
Sequência de restrição 
Extremidade 
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens
-G-G-A-T-C-C-
-C-C-T-A-G-
G-
Sticky
       
EcoRI
Escherichia coli
-G-A-A-T-T-C-
-C-T-T-A-A-
G-
Sticky

HindIII
Haemophilus influenzae
-A-A-G-C-T-T-
-T-T-C-G-A-
A-
Sticky
 
KpnI
Klebsiella pneumonia
-G-G-T-A-C-C-
-C-
C-A-T-G-G-
Sticky
 
PstI
Providencia stuartii
-C-T-G-C-A-G-
-G-
A-C-G-T-C-
Sticky

SacI
Streptomyces achromogenes
-G-A-G-C-T-C-
-C-
T-C-G-A-G-
Sticky

SalI
Streptomyces albue
-G-T-C-G-A-C-
-C-A-G-C-T-G-
Sticky

SmaI
Serratia marcescens
-C-C-C-G-G-G-
Blunt
-G-G-G-C-C-C-

SphI
Streptomyces phaeochromogenes
-G-C-A-T-G-C-
-C-G-T-A-C-
G-
Sticky


XbaI
Xanthomonas badrii
-T-C-T-A-G-A-
 -A-G-A-T-C-
T-
Sticky

Como identificar os fragmentos cortados?

A separação de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos pode ser feita através de um processo relativamente simples e rápido, a eletroforese em gel de agarose. Este gel representa, na verdade, uma “peneira” ou matriz capaz de retardar diferencialmente o movimento de moléculas de tamanhos variados. A molécula de DNA, devido à presença do ácido fosfórico, apresenta carga negativa, de modo que, quando submetida a um campo elétrico, em pH neutro, é atraída para o pólo positivo. A primeira etapa do processo da eletroforese consiste em se colocar numa cavidade ou poço, em uma das extremidades do gel, uma solução contendo a molécula do DNA cortado. Em seguida, deve-se fazer uma corrente elétrica passar pelo gel colocando o pólo positivo (ânodo) na extremidade oposta. Desta forma, após algum tempo, encontram-se, a partir do ponto de aplicação, as moléculas distribuídas em ordem decrescente de tamanho.

Para a visualização, o DNA é corado com um reagente fluorescente que se intercala na molécula, o brometo de etídio. Os fragmentos podem ser, então, observados sob luz ultravioleta (UV).

Sociedade Brasileira de Genética

Artigo por: Raphael Gonçalves Nicésio

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