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Eletroforese

A eletroforese é uma técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico.

O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo.

Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo.

Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso.
As amostras (de DNA, por exemplo) são colocadas com pipetas em pequenos poços no gel, que são feitos com um pente durante a sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.

A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.
Tanto na eletroforese com gel de acrilamida como na com gel de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia determinada tanto pela concentração do polímero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.

1 - Gel; 2 - Aplicação do marcador; 3 - Aplicação das amostras; 4 - Indução de corrente elétrica; 5 - Deslocamento e separação dos fragmentos; 6-Eletroforese realizada.


Eletroforese em gel de agarose

É empregada rotineiramente para separação de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero de elevado custo extraído de algas marinhas. Forma uma rede que “segura” as moléculas durante a migração.

Dependendo da concentração de agarose, tem-se uma diferença no gradiente de separação. Quanto maior a concentração, maior a capacidade de distinguir fragmentos, ou seja, maior a definição. Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.

Eletroforese em gel de poliacrilamida


A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma "rede".

Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização. A identificação dos produtos pode ser feita pelo brometo de etídio, mas o nitrato de prata é mais utilizado.


Fonte: Grumann, C. Eletroforese.

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